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Os reagentes preparados ou prontos para uso devem ser tratados como Para o cálculo de concentração, esse fator de diluição dever ser recuperado. resíduos perigosos de acordo com as normas de biossegurança. Diluição 1:10: 10 µL soro + 90 µL do Calibrador Zero (agite cuidadosamente) O kit DRG Estradiol Elisa é um teste imunoenzimático para a determinação quantitativa do Diluição 1:100: 10µL diluído a) 1:10 + 90µL Calibrador Zero (agite Estradiol em soro ou plasma (EDTA ou citrato). Este ensaio tem a finalidade somente para uso diagnostico in vitro. Cavidades recobertas com anticorpo policlonal anti-Estradiol. 2) Calibradores (0-6),7 x 1 mL, pronto para uso. Estradiol (1,3,5(10)-estratriene-3, 17Beta-diol; 17 beta-estradiol; E2) é um hormônio esteróide Concentrações: 0; 25; 100; 250; 500; 1000; 2000 pg/ml. Todas as amostras e reagentes devem ser mantidas a temperatura ambientes C18 com um anel A fenólico. Este hormônio esteróide tem um peso molecular de 272.4.É o 3) Conjugado Enzimático: 1 x 25 mL, pronto para uso. antes do uso. Todos os reagentes devem ser homogeneizados evitando a mais potente esteróide, produzido principalmente pelo folículo de Graffian do ovário feminino Anticorpo policlonal anti-Estradiol conjugado com Peroxidase e placenta e em menor quantidade pelas adrenais e testículos masculinos. 5) Solução de Substrato, 1 x 14 mL, pronto para uso. Uma vez iniciado o ensaio, todas as etapas devem ser cumpridas sem Estradiol é secretado na corrente sanguínea onde 98% circulam ligado a Globulina Ligada a Hormônio Sexual (SHBG) e em extensão menor ligado a outra proteína sérica como a 6) Solução de Parada, 1 x 14 mL, pronto para uso. Utilize ponteiras plásticas descartáveis novas para cada calibrador, controle e albumina. Somente uma pequena fração circula como hormônio livre ou na forma conjugada. amostras a fim de evitar contaminação cruzada. A atividade estrogênica é afetada via complexo estradiol-receptor na qual dispara a resposta Evite contato com a Solução de Parada. Pode causar queimaduras e irritação na pele. A absorbância ocorre em função do tempo de incubação e temperatura. Antes apropriada a nível nuclear nos locais de destino. Estes locais incluem os folículos, útero, 7)Solução de Lavagem, 1 x 30 mL ( concentrado 40x) de iniciar o ensaio é recomendado que todos os reagentes estejam prontos para mama, vagina, uretra, hipotálamo, glândula pituitária e numa extensão menor o fígado e pele. uso, tampas removidas, e todos os poços necessários também disponíveis para Em mulheres não grávidas com ciclo menstrual normal, a secreção do estradiol segue um uso. Esse procedimento assegura um gasto de tempo igual para cada passo do ciclo, padrão bifásico com a maior concentração encontrada imediatamente no pico da Equipamentos e material necessário, mas não fornecido ovulação. A elevação da concentração de estradiol é entendida a exercer influencia de Em geral, a reação enzimática é diretamente proporcional ao tempo e feedback positivo a nível de glândula pituitária onde influencia a secreção de gonadotrofinas, Micropipetas calibradas de precisão de volumes variáveis. Hormônio Folículo Estimulante (FSH), e Hormônio Luteinizante (LH), na qual são essenciais para a maturação folicular e ovulação, respectivamente. Seguindo a ovulação, níveis de estradiol caem rapidamente até as células lúteas tornarem ativas resultando numa subida Em cada corrida deve ser incluída uma curva padrão. suave secundária e platô do estradiol na fase lútea. Durante a gravidez, níveis séricos de Separe o número de tiras de poços necessárias para o ensaio no suporte. Papel semi-logaritimico ou programa para calculo de resultados ou leitora Estradiol materno aumentam consideravelmente, para bem acima dos níveis pré-ovulatório e Pipetar 25 µL de cada Calibrador, controle e amostras com ponteiras novas os níveis elevados são mantidos durante toda a gravidez. Dosagens de Estradiol sérico são valiosas na avaliação de uma variedade de disfunção Pipetar 200 µL de Conjugado Enzimático em cada cavidade. menstrual como puberdade precoce ou puberdade tardia nas meninas e amenorréia primaria Homogenize cuidadosamente por 10 segundos. É importante ter uma completa Quando armazenados entre 2-8°C e se os reagentes não estiverem abertos, a validade é até ou secundária e menopausa. Nível de estradiol baixo foi relatado em pacientes com síndrome a data de expiração marcada nos rótulos. Não use os reagentes após a data de validade. feminilizante, ginecomastia e tumores testiculares. Incubar por 120 minutos a temperatura ambiente sem cobrir a placa. Depois de abertos os reagentes devem ser armazenados entre 2-8°C. Microplaca deve ser Em casos de infertilidade, dosagem de estradiol sérico são uteis no monitoramento da Despreze o conteúdo das cavidades e lave cada cavidade por três vezes com a armazenada entre 2-8°C. Depois de aberta a embalagem da microplaca, retire a quantidade indução da ovulação seguindo o tratamento, como por exemplo, citrato de clomifeno, solução de Lavagem diluída (400 µL por cavidade). Remova toda a solução de necessária para trabalho e feche muito bem a embalagem novamente. Hormônio liberador de LH (LH-RH) ou gonadotrofinas exógenas. Durante hiperestimulação lavagem residual, batendo a placa invertida em papel absorvente. ovariana na fertilização in vitro (FIV), concentrações de estradiol sérico são normalmente Nota Importante: A sensibilidade e precisão desse ensaio são monitorada diariamente para otimizar o tempo exato da administração da Gonadotrofina Mantenha todos os reagentes e numero de tiras necessárias em temperatura ambiente antes diretamente influenciadas pela correta realização do procedimento Coriônica Humana e coleta dos oocistos. Pipetar 100 ul da Solução de Substrato em cada cavidade. Incubar por 15 minutos a temperatura ambiente. Adicionar água deionizada na Solução de Lavagem concentrada 40x. O kit DRG Estradiol Elisa é um teste imunoenzimatico de fase sólida, baseado no principio da Parar a reação enzimática adicionando 50 ul de Solução de Parada em cada Diluir 30 mL da Solução de Lavagem concentrada com 1170 mL de água deionizada para um competição pelos sítios de ligação do anticorpo com enzima. volume final de 1200 mL. Esta solução é estável por 02 semanas, para uso prolongado diluir As cavidades da microplaca estão cobertas com anticorpos policlonal de coelho dirigida ao Leia a densidade óptica a 450 ± 10 nm com Leitora de Microplaca dentro de 10 proporcionalmente a quantidade suficiente para a sua rotina. sitio antigênico da molécula de Estradiol. Estradiol endógeno da amostra do paciente minutos após a adição da Solução de Parada. compete com o anticorpo anti-Estradiol conjugado com Peroxidase pelas ligações do anticorpo coberto da placa. Depois da incubação, o conjugado não ligado é lavado e O descarte do kit deve ser de acordo com as normas de biossegurança desprezado. A quantidade de ligações do Conjugado Peroxidase é inversamente proporcional Calcular o valor médio das absorbâncias para o conjunto de Calibradores, a concentração de Estradiol na amostra. Depois da adição da solução de substrato, a intensidade da cor desenvolvida é inversamente proporcional a concentração de Estradiol nas Em caso de qualquer dano severo ao kit ou seus componentes, a DRG deve ser comunicada Construir uma curva padrão plotando a média das absorbâncias obtidas de cada por escrito no máximo após uma semana do recebimento do material. Qualquer componente calibrador contra a concentração. O valor da absorbância no eixo vertical (Y) e a concentração dos Calibradores no eixo horizontal (X). que estiver danificado não deve ser usado no ensaio. O material deve ser guardado até uma solução final ao problema. Depois, o material danificado deve ser descartado seguindo as Usando o valor da média das absorbâncias de cada amostra testadas, Este kit é apenas para uso diagnostico in vitro. determinamos a concentração correspondente através da curva de calibração. Para informações sobre substancia perigosas inclusas no kit, favor consultar o Método automático: Programas de computador utilizando curvas do tipo cubic spline, 4 PL ou Logito-Log costumam apresentar bom resultado. Todos os reagentes desse kit que contem soro ou plasma humano foram A concentração das amostras pode ser lida diretamente da curva de Soro ou plasma (EDTA, heparina ou citrato) podem ser usados com esse kit. testados e confirmados negativo para HIV I/II, HBsAg, e HCV por procedimentos Não use amostras hemolisadas, ictéricas ou lipêmicas. calibradores. Amostras com concentração superior a 2000 pg/ml (concentração aprovados pelo FDA. Entretanto, todos os reagentes devem ser tratados como Atenção: Amostras contendo Azida sódica não devem ser usadas com esse kit. do calibrador 6) devem ser diluídas, retestadas e ter seu valor corrigido pelo potencialmente perigosos no uso e devem ser descartados. fator de diluição utilizado, antes do resultado final. Evite contato com a Solução de Parada que contem Acido Sulfúrico 0,5 M. Pode causar queimaduras e irritação na pele. Abaixo temos um exemplo de uma curva padrão típica do ensaio DRG Estradiol ELISA Nunca pipete com a boca e evite contato com dos reagentes e amostras com a Coletar o sangue por punção venosa, aguardar a formação do coagulo e separar o soro através de centrifugação a temperatura ambiente. Não centrifugue antes da formação do Não fumar, comer, beber ou aplicar cosméticos nas áreas onde amostras e coagulo estiver completa. Pacientes recebendo terapia de anticoagulante pode precisar de um tempo maior para a formação do coagulo. Contaminação microbiológica de reagentes ou amostras podem apresentar Coletar o sangue por punção venosa e centrifugar imediatamente após a coleta, utilizando os Manipulação deve ser realizada de acordo com as normas e práticas de Não utilize reagentes com os prazos de validade vencidos conforme Amostras devem ser guardadas em tubos tampados e armazenados por até cinco dias a É recomendado que cada laboratório determine seus próprios valores normais ou alterados. Todos os volumes indicados devem ser seguidos conforme as instruções de Estudo conduzido com adultos, aparentemente sadios, utilizando o kit DRG Estradiol Elisa, uso. Ótimos resultados somente são obtidos quando utilizado pipetas Amostras guardadas por um longo período devem ser congeladas a -20°C antes do ensaio. Amostras descongeladas devem ser muito bem homogeneizadas, por inversão, antes de Não misture ou use componentes de kits de lotes diferentes. Não se devem misturar tiras de cavidades de diferentes microplacas mesmo que de mesmo lote. Os kits podem ter sido enviados ou armazenados em diferentes condições e as características de ligação dos ensaios nessas placas podem se apresentar Se no ensaio, uma amostra apresentar valor de concentração maior que o maior valor de calibrador, essa amostra pode ser diluída a 1:10 e 1:100 com o calibrador zero e a amostra deve ser retestada conforme descrito no Procedimento do Ensaio. Atenção: Somente os resultados não devem ser utilizados isoladamente na conduta O resultado do teste em si nunca deve ser o único determinante para aplicar qualquer terapêutica. Os resultados devem ser correlacionados com outras observações clinicas e Amostras foram enriquecidas com a adição de solução de Estradiol com concentração O valor esperado foi calculado pela adição da metade do valor determinado pela amostra não diluída e metade do valor da solução conhecida. A % de recuperação foi calculada pela Qualquer modificação no teste do kit e/ou troca ou mistura de qualquer componente de É recomendada a utilização de amostras controle. O uso de controles é para assegurar a multiplicação da taxa da medida e os valores esperados por 100. diferentes lotes pode afetar negativamente a finalidade dos resultados e a validade de todo o validade dos resultados dia a dia. Usar controles de níveis normais e patológicos. teste. Qualquer modificação e/ou troca invalida qualquer reclamação para troca. Os controles e os resultados correspondentes dos controles estão registrados no Certificado Reclamações também serão invalidadas devido a erros de interpretação dos resultados do de Controle de Qualidade do kit. Os valores e faixas de valores registradas no Certificado de laboratório pelos clientes, objeto da conduta terapêutica. Controle de Qualidade referem-se ao lote do kit que está sendo utilizado e deve ser utilizado Indiferente, no caso de qualquer reclamação, a responsabilidade do fabricante não excede o em comparação direta com os resultados. valor do kit. Qualquer problema causado ao kit durante o transporte não esta sujeito a Também é recomendada a utilização de programas de controle de qualidade Nacional e Internacional a fim de assegurar a precisão dos resultados. Empregar métodos estatísticos apropriados na analise dos controles e tendências de curva. Se os resultados dos controles do ensaio não estiverem dentro dos limites aceitáveis Flier, J.S., Kahn, C.R. and Roth, J. (1979). Receptors, antireceptor antibodies and mechanisms of insulin resistance; N.Engl. J. Med., 300, 8, 413-419. estabelecidos, os resultados dos pacientes devem ser considerados inválidos. Frier, B.M., Ashby, J.P., Nairn, I.M. and Bairs, J.D. (1981). Plasma insulin, C-peptide and Neste caso, conferir as seguintes páreas técnicas: pipetagem e tempo de incubação; glucagon concentrations in patients with insulin-independent diabetes treated with fotômetro data de validade dos reagentes, condições de armazenagem e incubação e chlorpropamide. Diab. Metab., 7,1, 45-49. métodos de lavagem e aspiração das cavidades de amostras. Judzewitsch, R.G., Pfeifer, M.A., Best, J.D., Beard J.C., Halter, J.B. and Porte D. Jr. (1982). Após conferir os itens acima mencionados sem encontrar nenhum erro, favor contatar o Chronic Chlorpropamide therapy of non-insulin-dependent diabetes augments basal and stimulated insulin secretion by increasing islet sensitivity to glucose. J. Clin. End. And Metab. 55, Kosaka, K., Hagura, R. and Kuzuya, T. (1977). Insulin response in equivocal and definite diabetes, with special reference to subjects who had mild glucose intolerance bu later developed definite diabetes. Diabetes 26, 10, 944-952. A faixa do ensaio está entre 9.7 – 2000 pg/ml. Starr, J. Il, Mako, M. E., Juhn, D. and Rubenstein, A.H. (1978). Measurement of serum proinsulin- like material: cross-reactivity of porcine and human proinsulin in the insulin radioimmunoassay, J. Especificidade dos Anticorpos (Reação Cruzada) Baird, D.T., Ovarian steroid secretion and metabolism in women. In: The Endocrine Function of As seguintes substancias foram testadas para Reação Cruzada para esse ensaio: the Human Ovary. Eds.: James, V.H:T., Serio, M. and giusti, G. pp. 125-33, Academic Press, McNastty, K.P., Baird, D.T., Bolton, a., Chambers, P., Corker, C.S. and McLean, H., concentration of oestrogens and androgens in human ovarian venous plasma and follicular fluid throughout the menstrual cycle, J.Endocrinol. 71:77-85 (1976). Abraham, G.E. Odell, W.D., Swerdloff, .S., and Hopper, K., Simultaneous radioimmunoassay of plasma FSH, LH, progesterone, 17-hydroxyprogesterone and estradiol-17B during the menstrual cycle, J.Clin. Endocrinol. Metab. 34:312-18 (1972) March, C.M., Goebelsmann, U., Nakumara, R.M., and Mishell, D.R., Roles of oestradiol and progesterone in eliciting midcycle luteinizing hormone and follicle stimulating hormone surges. J. clin. Endicrinol. Metab. 49:507-12 (1979). Simpson, E.R., and McDonald, P.C., Endocrinology of Pregnancy. In: Textbook of Endocrinology, Ed.: Williams, R.H. PP412-22, Saunders Company, Philadelphia (1981) Jenner, M.R., Kelch, R.P., et al., Hormonal Changes in prepubertal children, pubertal females and in precocious puberty, premature thelarche, hypogonadism and in a child with feminizing tumor, J. clin. Endocrinol. 34:521 (1982). Goldstein, D. et al., Correlation between oestradiol and progesterone in cycles with luteal phase deficiency, Fertil. Steril. 37: 348-54 (1982). Kirschnner, M.A., therole of hormones in the etiology of human cancer, Cancer 39:271626 Odell, W.D. and Swerdloff, R.D., Abnormalities of gonadal function in man, clin. Endocr. 8:149-80 McDonald, P.c., Madden, J.C., Brenner, P.f., Wilson, J.D. and Siiteri, P.K. Origin of oestrogen on normal man and woman with testicular feminisaion, J.Clin. Endcrinol. Metabol. 49:905 (1979). Peckham, MJ: and McElwain, T.J:, Testicular tumours, J.Clin. Endocrinol. Metab. 4:665-692 Taubert, H.d. and Dericks-Tan, J.s.E., induction ofr ovulation by clomiphene citrate in combination with high doses of oestrogens or nasal application of LH-RH. In: Ovulation in the Human. Eds.: Crosignandi, P.G. and Mishell, D.R., pp.265-73, Academic Press, New York (1976). Fishel, S.B., Edwards, R.G., Purdy, J.J., Steptoe, P.C., Webster, J. Walters, E, Cohen, J. Qualquer manipulação imprópria ou modificação nesse teste pode influenciar nos resultados. Fehilly, C. Hewitt, J., and Rowland, G., Implantation abortion and birth in-vitro ferilisation using Hemoglobina (até 4 mg/mL), bilirrubina (ate 0,5 mg/mL) e triglicérides (até 30 mg/mL) não the natural menstrual cycke I follicular stimulation with clomiphene citrate and human menopausal gonadotropina, J. In Vitro Fertil. Embryo Transfer, 1:24-28 (1985). Até o momento não há evidencias de drogas conhecidas que interfiram na dosagem das amostras de Estradiol. Não foi observado efeito gancho nesse ensaio. Rua Apinajés, 1694 (antigo Dr. Paulo Vieira, 91) A sensibilidade analítica foi calculada pela média menos dois desvios padrões de vinte CEP.01258-000 - Pompéia - São Paulo - SP analises em replicata do Calibrador Zero e o resultado foi de 9.714 pg/ml. O ensaio deve ser realizado exatamente conforme as instruções de uso do fabricante. Alem Técn. Resp. Dra. Renata Zuculin de Oliveira - CRF-SP 37986 disse o usuário deve praticar as regras da Boa Pratica de Laboratório ou outro método Para uso exclusivo diagnóstico "in vitro" aplicável. Isto é especialmente relevante no uso de reagente controle. É importante sempre A variação do ensaio é mostrada abaixo; incluir, dentro do procedimento do ensaio, um numero suficiente de controles para a validação O ensaio só será validado se todos os controles estiverem dentro da faixa especificada e se todos os outros parâmetros também estiverem dentro das especificações do teste. Em caso PARA DESCARTE, CONSULTAR INSTRUÇÕES DE USO Quaisquer dúvidas técnicas no manuseio deste kit ou no seu procedimento, contatar a nossa A variação entre o ensaio é mostrado abaixo As condutas terapêuticas nunca devem ser baseadas nos resultados do laboratório, só Atendimento ao consumidor - Fone (011)-3871-0095 mesmo se todos os resultados do ensaio estiverem de acordo com os itens listados anteriormente. Qualquer resultado é parte do quadro clinico total do paciente. Somente nos casos onde os resultados do laboratório estão em concordância com a avaliação clínica do paciente, as condutas terapêuticas podem ser aplicadas.

Source: http://www.biomedix.com.br/bulas/drg/ESTRADIOL%20%20DRG.pdf

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