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Pesq. Vet. Bras. 24(3):115-119, jul./set. 2004 Uso da ciclofosfamida em modelo de imunodepressão Maurício Garcia2, Silvio P. Sertório2, Glaucie J. Alves2, Sabrina C. Chate2, Roberta Garcia M., Sertório S. P., Alves G. J., Chate S. C., Carneiro S. & Lallo M.A. 2004. [Ovine experimental immunosuppression using cyclophosphamide.] Uso da ciclofosfamida emmodelo experimental de imunodepressão experimental em ovinos. Pesquisa Veterinária Brasileira24(3): 115-119. Curso de Medicina Veterinária, Universidade Paulista, Rua Enjolras Vampré 146,São Paulo, SP 04290-070, Brazil. E-mail: mgar@mgar.vet.br Cyclophosphamide (CY) was used to evaluate the effect on the immune system of sheep. Castred adult rams were divided into 3 groups, with 6 animals each one. Group I (day 0) and Group II (day1) were treated with CY (40 mg/kg, single dose, IV), and Group III was not treated and remained ascontrol. All groups were immunized on day 0 with B19 brucellosis vaccine. On day 6, all animalswere bled and serum agglutination test for brucellosis antibodies detection was performed. During7 days blood lymphocyte counts and electrophoresis gammaglobulin dosage were daily performed.
The results showed statistical decrease of immune response. Low serum titers of brucellosisantibodies were found in Groups I and II, and lymphopenia and hypogammaglobulinemia werealso found in these groups. A high mortality rate (40%) occurred in the treated animals.
INDEX TERMS: Immunosupression, cyclophosfamide, immunology, sheep.
RESUMO.- A ciclofosfamida (CY) foi usada para avaliar o efeito no sistema imune de ovinos. Carneiros adultos castrados foram As mudanças recentes na pecuária brasileira e mundial apontam divididos em 3 grupos, com 6 animais cada. Os Grupos I (dia 0) para um novo paradigma de criação, em que o uso de defensi- e II (dia 1) foram tratados com a CY (40 mg/kg, dose única, IV), e vos animais é limitado ao mínimo indispensável, senão comple- o Grupo III não foi tratado, permanecendo como controle. To- tamente abolido, no sentido de serem produzidos alimentos, dos os grupos foram imunizados no dia 0 com a vacina B19 tanto carne quanto leite, isentos de quaisquer resíduos quími- contra a brucelose. No dia 6, todos animais foram sangrados e cos. A palavra de ordem hoje é a prevenção e manutenção de foi realizado o teste de soro-aglutinação para detecção de animais sadios para que possam utilizar as suas próprias defesas anticorpos anti-brucella. Foram também realizadas, diariamente para o combate das diversas enfermidades que são comuns em durante 7 dias, contagens de linfócitos sangüíneos e dosagens rebanhos submetidos a manejos intensivos.
de gamaglobulinas séricas por eletroforese. Os resultados en- O estudo do sistema imune dos ruminantes desempenha, contrados mostraram uma diminuição estatística da resposta assim, um papel chave neste cenário. Dentro deste contexto, os imune. Foram encontrados, nos Grupos I e II, baixos títulos de modelos experimentais de imunodepressão apresentam-se como anticorpos anti-brucella, além de linfopenia e hipogamaglo- uma valiosa ferramenta para avaliar o comportamento do siste- bulinemia. Uma alta mortalidade (40%) foi encontrada nos ani- ma imune. O estabelecimento de tais modelos, bem documenta- dos e com boa reprodutibilidade, permite a realização de inúme- TERMOS DE INDEXAÇÃO: Imunodepressão, ciclofosfamida, ros experimentos, tais como a avaliação do efeito de imuno- moduladores e o desenvolvimento de novas técnicas demensuração da resposta imune.
Diversas drogas têm sido empregadas em modelos de imunodepressão em várias espécies, como a dexametasona, a Aceito para publicação em 14 de maio de 2003.
ciclosporina, a ciclofosfamida e o metotrexato. Todavia, o efeito Trabalho realizado com suporte financeiro da FAPESP, Proc. nº 99/10980-3.
2 destas drogas não é o mesmo em todas as espécies. O Curso de Medicina Veterinária, Universidade Paulista, Rua Enjolras Vampré 146, São Paulo, SP 04290-070. E-mail: mgar@mgar.vet.br metotrexato, por exemplo, é capaz de inibir a resposta imune em camundongos tratados com 2,5 mg/kg em dose única et al. 1969, McIntosh et al. 1971, Bakke et al. 1972, Jackson et al.
(Romanycheva et al. 1978). Entretanto, Greenwood & Keny (1978) 1975, Bogdanov & Kusnedelcheva 1977, Gordon 1982, Yegana não conseguiram provocar alterações hematológicas em ovinos tratados durante 3 dias com 5 mg/kg de metotrexato.
O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito da Em camundongos, Doherty (1981) mostrou que a ciclofos- ciclofosfamida em um modelo de imunodepressão em ovinos, famida inibe a produção de anticorpos, mas não conseguiu de- através da titulação de anticorpos anti-brucella, pós-vacinais, e monstrar o efeito da droga na resposta celular cutânea. Já Tarayre também pela contagem de linfócitos sangüíneos e pela dosagem et al. (1990) encontraram leucopenia em camundongos trata- Outro exemplo desta diversidade de efeito é a dexametasona, um potente glicocorticóide usado em diversos modelos de Foram utilizados 18 ovinos sem raça definida, machos adultos e imunodepressão. Tal efeito foi bem documentado em várias es- castrados, com pesos ao redor de 35 kg. Os animais foram mantidos pécies, como bovinos (Roth & Kaerbele 1985, Pruett et al. 1987, em baias com cama de serragem e alimentados com feno de alfafa.
Doherty et al. 1995), ratos (Wira et al. 1990, Bakker et al. 1997) e Foram constituídos 3 grupos experimentais, com 6 animais cada até galinhas (Isobe & Lillehoj 1993). Todavia, Saulnier et al. (1991) grupo. Os animais dos Grupos I e II receberam 40 mg/kg de falharam ao tentar demonstrar o efeito imunodepressor da ciclofosfamida (Genuxal®, Asta Médica) por via intravenosa e os dexametasona em suínos e Minton & Blecha (1991) e Garcia et al.
animais do Grupo III permaneceram como controle.
(1999) também não conseguiram encontrar tal efeito em ovinos.
Pretendeu-se avaliar a capacidade dos animais em produzir Esses resultados ressaltam a necessidade de serem desenvol- anticorpos específicos após a aplicação de determinado antígeno.
vidos modelos próprios para cada espécie, já que as conclusões Para tanto, foi utilizada a vacina contra a brucelose bovina como obtidas em uma espécie não podem necessariamente ser antígeno. Assim, todos os animais foram imunizados com 2 ml de vacina contra a brucelose, amostra B19 (Aborvac®, Fort Dodge), porvia subcutânea. Seis dias após a vacinação, foi feita a titulação de A ciclofosfamida é uma mostarda nitrogenada que tem sido anticorpos anti-brucella, através da soro-aglutinação rápida em placa.
usada no tratamento de diversos tipos de câncer. A droga é um A técnica empregada é uma variante da técnica tradicional descrita potente imunodepressor, atuando em células com alta atividade por Huddleson & Abel em 1928 e foi padronizada por Garcia et al.
mitótica, inibindo tanto a resposta imune humoral quanto celu- (2000). O soro foi previamente diluído com solução salina (0,9% NaCl), de acordo com as seguintes concentrações: 1:1, 1:5, 1:10, 1:20, 1:30, Um dos efeitos colaterais da ciclofosfamida, a queda de ca- 1:40, 1:50, 1:60, 1:70, 1:80, 1:90 e 1:100. De cada diluição, 100µl belos, chamou a atenção de alguns pesquisadores para a possi- foram misturados com 50µl de um antígeno comercial para bilidade do uso da droga para facilitar a tosquia em ovinos.
diagnóstico da brucelose bovina (Instituto Butantan) sobre uma placa Logo, surgiram várias publicações sobre a chamada “tosquia de vidro. A mistura foi suavemente homogeneizada e, após 8 minutos, química” com a ciclofosfamida, como citado em Homan et al.
foi avaliada a aglutinação. O título foi o correspondente à maior (1969) e Dolnick et al. (1969). Nestes animais, a lã pode ser com- diluição que apresentou reação com aglutinação positiva.
pletamente removida com a mão ao redor do 10o dia após a Para se avaliar o melhor momento para a aplicação da ciclofos- famida, com relação ao momento da imunização anti-bruclla, osanimais do grupo I foram imunizados no mesmo dia em que foram O uso da ciclofosfamida em ovinos levou pesquisadores como tratados com a ciclofosfamida e os animais do grupo II foram Bakke et al. (1972) e Schaumloffel et al. (1973) a estudar o seu metabolismo nesta espécie. Além destes pesquisadores, muitos Como elementos adicionais para a avaliação do sistema imune, outros se dedicaram ao tema e vários aspectos foram descritos, foi feita a contagem de linfócitos sangüíneos em câmara hemati- como o efeito no bulbo folicular da lã, na atividade testicular, na métrica e extensões sangüíneas (Hewitt 1984) e a dosagem de gama- gestação, na atividade da acetilcolinesterase, no crescimento da globulinas séricas, por eletroforese (Barta & Pourciau 1984). Tais lã e nas infecções micóticas (Dolnick et al. 1970, McIntosh et al.
avaliações foram feitas diariamente, durante uma semana após a Apesar desta grande variedade de trabalhos, são poucos os Os dados foram analisados estatisticamente por análise de estudos específicos sobre o efeito da ciclofosfamida no sistema variância (Zar 1996), para um valor de p=5%. Foi empregada planilha imune de ovinos. Prasad et al. (1986) estudaram o efeito da dro- eletrônica comercial (Excel 97®, Microsoft) de acordo com as ga na resposta à vacinação contra o ectima contagioso. Bogda- recomendações de Dretzke & Heilman (1998).
nov & Kusnedelcheva (1977) encontraram hipogamaglo-bulinemia em ovelhas adultas tratadas com ciclofosfamida. Jun & Johnson (1979) relataram o efeito imunosupressor da droga Os resultados da titulação de anticorpos vacinais anti-brucella em ovinos com carcinoma induzido experimentalmente. Yegana mostraram haver uma diminuição estatisticamente signi- et al. (1983) não conseguiram evidenciar significativas altera- ficante nos animais dos grupos I (média = 1,4) e II ções leucocitária ou na fração de gamaglobulina após a aplica- (média = 11,5) , com relação ao grupo controle (média = 37,5).
Notou-se, ainda, que a média do grupo I foi menor que a encon- Diversos protocolos para o uso da ciclofosfamida em ovinos trada no grupo II, mostrando que a aplicação simultânea da têm sido propostos, com diferentes propósitos, com doses vari- ciclofosfamida no momento da imunização provoca uma ando de 10 a 50 mg/kg, tanto via oral quanto intravenosa (Dolnick imunodepressão mais intensa do que aquela obtida com a apli- Pesq. Vet. Bras. 24(3):115-119, jul./set. 2004 Uso da ciclofosfamida em modelo de imunodepressão experimental em ovinos cação da ciclofosfamida um dia antes da imunização (Quadro 1,Fig. 1).
Nos animais tratados com ciclofosfamida, encontrou-se uma intensa linfopenia (Quadro 2, Fig. 2). A linfopenia já pode serdetectada 24 horas após a aplicação da droga, atingindo seupatamar mais baixo ao redor do 4o e 5o dia, iniciando, então,uma lenta recuperação.
Com relação aos valores da gamaglobulina, os resultados foram mais discretos, mas ainda estatisticamente significantes.
Quadro 1. Títulos de anticorpos vacinais anti-brucella em ovinos tratados com ciclofosfamida no dia 0 (Grupo Fig. 1. Títulos de anticorpos vacinais anti-brucella em ovinos tratados I), no dia -1 (Grupo II) e sem tratamento (Grupo III) com ciclofosfamida no dia 0 (Grupo I), no dia -1 (Grupo II) e semtratamento (Grupo III).
Quadro 3. Valores da gamaglobulina sérica (em mg/dl) de ovinos tratados com ciclofosfamida no dia 0 (Grupo I), no dia -1 (Grupo II) e sem tratamento (Grupo III) a Médias estatisticamente menores com relação ao grupo controle (III).
Quadro 2. Valores de linfócitos sangüíneos (em céls./µl) de ovinos tratados com ciclofosfamida no dia 0 (Grupo I), no dia -1 (Grupo II) e sem tratamento (Grupo III) a Médias estatisticamente menores com relação ao grupo controle (III).
= Animais que morreram.
Conforme exposto no Quadro 3 e na Fig. 3, notou-se uma hipogamaglobulinemia nos animais dos Grupos I e II. A hipogamaglobulinemia torna-se evidente ao redor do 2º dia após a aplicação da droga, atingindo seu patamar mais baixo ao re- Os animais tratados com ciclofosfamida apresentaram que- da de lã que se iniciou ao redor do 3º dia após a aplicação da Médias estatisticamente menores com relação ao grupo controle (III).
Pesq. Vet. Bras. 24(3):115-119, jul./set. 2004 Os resultados encontrados mostraram claramente o efeito imunodepressor da ciclofosfamida. Os animais do grupo con-trole apresentaram aglutinação de seu soro frente ao antígenobrucélico mesmo quando seu soro era previamente diluído, emalguns casos, até 60 vezes. Já alguns animais inoculados nãoapresentavam tal aglutinação, mesmo com o soro puro, semdiluição. Resultado semelhante foi encontrado por Prasad et al.
(1986), que encontraram forte imunodepressão em animais imu-nizados contra o ectima contagioso, após serem tratados com aciclofosfamida.
A linfopenia e a hipogamaglobulinemia encontrada nos ani- mais inoculados reforçaram também esse efeito imunodepressor.
Fig. 2. Valores de linfócitos sangüíneos de ovinos tratados com Cabe ressaltar, porém, que a linfopenia foi um resultado mais ciclofosfamida no dia 0 (Grupo I= o), no dia -1 (Grupo II= +) e expressivo que a hipogamaglobulinemia. Esse achado semelhante ao relatado por Silva (2000), parece sinalizar que a dosagem degamaglobulinas não é um indicador tão seguro de imunode-pressão; ao menos não parece ser muito sensível.
A escolha da ciclofosfamida baseou-se na indicação pré-exis- tente na literatura (Bogdanov & Kusnedelcheva 1977, Jun &Johnson 1979, Yegana et al. 1983, Prasad et al. 1986) e na facili-dade de aquisição no mercado a um custo razoavelmente aces-sível (Genuxal®, Asta Médica). A escolha da dose de 40 mg/kgtambém se baseou na literatura, que indica doses de 10 a 50 mg/kg (Quadro 1). Entretanto, observou-se uma alta mortalidadenos animais inoculados (40%), fato que indica a necessidade dereconsideração dessa dose em experimentos dessa natureza.
Portanto, seria conveniente retestar a ciclofosfamida com umadose menor para verificar se é possível repetir o efeitoimunodepressor observado neste trabalho, todavia, com umaprovável redução significativa da mortalidade.
Fig. 3. Valores da gamaglobulina sérica de ovinos tratados com ciclofosfamida no dia 0 (Grupo I= o), no dia -1 (Grupo II= +) e Com base nos resultados obtidos concluimos que a ciclofos-famida pode ser usada em modelo de imunodepressão em ovi- total da lã (Fig. 4). Dos 12 animais inoculados, cinco morreram, nos, pois é capaz de causar diminuição na produção de anticorpos perfazendo uma mortalidade de 40%. Das cinco mortes, três vacinais, linfopenia e hipogamaglobulinemia. Por outro lado, o ocorreram na primeira semana após a aplicação da droga e duas efeito da diminuição de anticorpos vacinais ocorre de maneira mais tardiamente. Os animais apresentaram lesões degenerativas mais intensa quando a droga é aplicada no mesmo momento da imunização, em comparação ao efeito obtido quando da aplica-ção um dia antes. Na dose de 40 mg/kg, usada neste experimen- to, a ciclofosfamida mostrou-se relativamente tóxica, causandomortalidade de 40% dos animais inoculados.
Os experimentos com imunologia aplicada à clínica dependemsubstancialmente do desenvolvimento de modelos de boareprodutibilidade. O que parece simples à primeira vista, muitas vezes se revela complexo no momento da execução. Por outro Bach J.F. & Strom T. 1986. The Mode of Action of Immunosuppressive lado, modelos considerados bons para uma determinada espé- cie nem sempre se aplicam a outra. Em experimento anterior, Bakke J.E., Feil V.J., Fjelstul C.E. & Thacker E.J. 1972. Metabolism of Garcia et al. (1999) não conseguiram provocar imunodepressão cyclophosphamide by sheep. J. Agr. Food Chem. 20(2):384-388.
em ovinos com a dexametasona, resultado semelhante ao en- Bakker J.M., Schmidt E.D., Kroes H., Kavelaars A., Heijnen C.J., Tilders F.J. & contrado por Minton & Blecha (1991), apesar de diversos auto- Van Rees E.P. 1997. Effects of neonatal dexamethasone treatment on res terem obtido sucesso em provocar a imunodepressão com a hypothalamo-pituitary adrenal axis and immune system of the rat. J.
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mesma droga em outras espécies (Roth & Kaerbele 1985, Pruettet al. 1987, Wira et al. 1990, Isobe & Lillehoj 1993, Doherty et al.
Barta O. & Pourciau S.S. 1984. Electrophoresis, p.116-122. In: Barta O.
(ed.) Laboratory Techniques of Veterinary Clinical Immunology. Charles 1995, Bakker et al. 1997). Assim, a principal motivação deste experimento foi a de avaliar o efeito de outra droga, a Bogdanov M. & Kusnedelcheva S. 1977. Chemical and hematologic studies ciclofosfamida, em modelo de imunodepressão em ovinos.
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Source: http://www.mgar.com.br/mgPdf/pesqVetBras2004.pdf

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Dott. Daniele FarinaCurriculum formativo /professionale Titoli di StudioLaurea in Medicina e Chirurgia presso l’Università di Torino conseguita il 30.10.78 con lode Specializzazione in clinica Pediatrica presso l’Università di Torino conseguita il 02.07.81 con lodePerfezionamento in Neonatologia presso l’Università di Verona conseguita il 17.11.83Idoneità Nazionale a Primario di Pediatr

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