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Solicitud de propuesta de investigación
Fecha de solicitud (30/01/11): Fecha de aprobación (dd/mm/aa): 1. Información del proyecto
Título del proyecto: Estudios de polimorfismos genéticos y de biomarcadores
emergentes asociados a la nefropatía diabética
Investigador principal: Clara Barrios Barrera
Filiación institucional: Servicio de Nefrología. Parc de Salut Mar. UAB.
Barcelona.

Área temática a la que pertenece el proyecto: Nefropatía Diabética
Co-autores del proyecto
Nombre E-mail Teléfono Responsabilidad


2. Precisará muestras del Biobanco SI NO
En caso afirmativo, especificar financiación esperada: Para la elaboración de este proyecto se solicitara Beca FIS del ISCII. 3. Resumen del proyecto
Antecedentes y estado actual del tema:
La nefropatía diabética (ND) es la principal causa de enfermedad renal terminal en
el primer mundo. En España, el 21% de los pacientes que inician programa renal
sustitutivo tienen como enfermedad de base la ND (1). Los avances realizados en
los últimos años en el entendimiento de la patogénesis de la ND, abren nuevas expectativas en las posibilidades terapéuticas y en su profilaxis. No obstante, a pesar de este progreso muchos enfermos todavía evolucionan hacia la necesidad de tratamiento renal sustitutivo, por lo que parece evidente que es imprescindible avanzar en el campo de la investigación de esta prevalente patología que alcanza baremos de pandemia. La ND es una complicación microvascular de la diabetes (DM) de causa multifactorial, estando implicados factores metabólicos, hemodinámicos, hormonales y genéticos. Dentro de los factores metabólicos, es de especial interés el papel que juega el trasportador de glucosa Glut-1. Se trata de un trasportador de glucosa de difusión facilitada, de distribución ubicua y en el glomérulo supone la
principal fuente de absorción de glucosa de las células mesangiales (2). Distintos
trabajos han demostrado que el estimulo de la glucosa produce una sobrexpresión de este transportador jugando un papel importante en la glomerulopatía diabética. El grupo de Linden KC y col. observó en un modelo murino hipertenso y diabético, que la expresión renal del Glut-1 estaba aumentada en los animales diabéticos, así como la excreción urinaria de factores de crecimiento como el TGF-β1 (3). Estos hallazgos fueron corroborados en trabajos posteriores con modelos animales de diabetes tipo 1 y en estudios en humanos con diabetes tipo-2, donde también se observó un aumento de la expresión renal del trasportador Glut-1 tanto a nivel glomerular como tubular (4). En cultivos de células mesangiales modificadas Solicitud de propuesta de investigación
genéticamente para sobrexpresar el Glut-1 se ha podido identificar una mayor producción de proteínas formadoras de matriz mesangial como la fibronectina y el colágeno I y IV, así como un aumento de la expresión génica de factores de crecimiento como el TGF-β1 y el VGEF (5). Sustentando los resultados que sugieren una relación entre el Glut-1 y la ND, se han publicado los resultados de un modelo de ratón que sobrexpresa Glut-1 únicamente en las células mesangiales. Aquellos ratones transgénicos mostraron mayor grado de albuminuria que los controles y el estudio anatomopatológico reveló cambios similares a los observados en la ND en los ratones que sobrexpresaban el transportador (6). De manera contraria, el “silenciado génico” del Glut-1 en las células mesangiales demostró una disminución en la absorción de glucosa así como una normalización en la expresión de las proteínas de matriz extracelular y factores de crecimiento. Por otra parte, las evidencias in vivo sugieren que, incluyendo el transgen “Glut-1 antisentido” en animales diabéticos tipo 2 (db/db) se protege contra el desarrollo de glomerulopatía diabética (7). Existen evidencias de la relación existente entre el Glut-1 y factores de crecimiento y activación tisular como el TGF-β, el cual se sabe que juega un papel fundamental en la patogénesis de la ND como activador de la producción de proteínas de matriz mesangial. Estudios realizados en cultivos de células mesangiales, demostraron que el TGF-β es capaz de activar por si mismo la expresión del Glut-1 de las células y de aumentar la actividad de transporte de glucosa. Además se demostró que la adición de un anticuerpo neutralizante de TGF-β en los medios de cultivo, revertía el efecto estimulatorio de la glucosa sobre la expresión del Glut-1. Estos experimentos demuestran la existencia de un eje Glut-1/TGF-β cuya activación da como resultado final el acúmulo de matriz mesangial (8). El sistema renina-angiotensina-aldosterona (SRAA) es un regulador de la función cardiovascular y renal por lo que no es extraño que las alteraciones en este sistema jueguen un papel crucial en la fisiopatología de varias enfermedades renales como la ND. Dentro de la cascada hormonal que supone este sistema la Angiotensina II (Ang-II), actuando a través de la activación de los receptores tipo 1 (ATR1), presenta un papel fundamental en el desarrollo de la ND con una función vasoconstrictora y proliferativa. Hasta la fecha, la mayor parte de la investigación tanto básica como clínica se ha centrado en los mecanismos que controlan la formación de Ang-II. Es decir, los sustratos proximales, el angiotensinógeno, la ECA y los ATR1. De hecho una de las principales dianas para retrasar la progresión de la insuficiencia renal y la proteinuria es el bloqueo del SRAA. Sin embargo, muchos pacientes progresan hasta ERCT a pesar del uso de estas estrategias. Estudios experimentales demuestran una relación entre el SRAA y el transportador Glut-1 y sugieren que el aumento de glucosa intracelular activa el SRAA. El grupo de Quinn realizó estudios in vitro, investigando el papel de la Ang-II en la mediación del Glut-1 en células vasculares de músculo liso. Observaron que las células pre-incubadas con Ang-II, aumentaron la expresión proteica del Glut-1. Simultáneamente, la Ang-II promovió el aumento de la absorción celular de glucosa en una relación dependiente del tiempo de exposición y de las dosis utilizadas (9). Otros autores investigaron el papel de la Ang-II sobre la expresión génica del Glut-1 en células mesangiales, demostrando un incremento del ARNm del Glut-1 en estas células dependiente del tiempo y de las dosis de Ang-II a las que fueron expuestas (10). Otros trabajos realizados en células mesangiales, valoraron el papel de la glucosa en el medio extracelular sobre los efectos dependientes de Ang-II en la degradación y formación de matriz mesangial. La células mesangiales de rata expuestas a concentraciones elevadas de glucosa aumentaron la producción de Ang-II y la expresión TGF-β1 fibronectina y colágeno. El uso concomitante de inhibidores de los receptores AT1R revirtió los hallazgos observados (11). En modelos animales de ratas con diabetes tipo 1 se observó que la administración de un inhibidor de la ECA (ramipril), disminuía los niveles de Ang- Solicitud de propuesta de investigación
II y la expresión renal del Glut-1. En resumen, analizando la secuencia de mecanismos implicados en el desarrollo de la ND, podemos ver como se implican diferentes sistemas y mecanismos fisiopatológicos. La hiperglucemia y la hipertensión glomerular aumentan la expresión de los trasportadores Glut-1, la formación de Ang-II y de TGF-β1. Estos sistemas además, parecen estar interrelacionados entre si. Hay distintas evidencias que apoyan el concepto de que existe una predisposición genética al desarrollo de ND. En primer lugar, se sabe que un importante porcentaje de la población diabética desarrolla daño renal a pesar de un relativo buen control de la glucemia y que por el contrario algunos pacientes con diabetes de larga evolución parecen presentar protección frente a la afectación renal, de hecho, hay series que demuestran que tras 10-20 años después del diagnostico de DM solo el 25-40% de los pacientes han desarrollado ND (12). En segundo lugar, numerosos estudios han mostrado una asociación familiar estando el riesgo de padecer ND aumentado tres veces si existe un familiar emparentado afectado. Más aun, si los padres del paciente diabético presentan hipertensión, es más probable que se desarrolle ND, indicando que los genes que confieren riesgo de hipertensión en la población general predisponen a la afectación renal en la DM (13). Distintos estudios han examinado el papel potencial de diversos genes como candidatos a conferir susceptibilidad de padecer ND. Entre otros destacamos el gen del transportador Glut-1 (SLC2A1), genes relacionados con el SRAA (ACE1, AGTR1, AGT) y con factores de crecimiento (TGFβ1, TGFβ1R). Respecto al Glut-1 la mayoría de los estudios se han centrado en valorar el single nucleotide polymorfism (SNP) XbaI obteniendo diversos resultados. Algunos trabajos no encontraron relación entre este SNP y el riesgo de ND en población con DM tipo2 española o DM tipo 1 danesa, sin embargo sí mostró estar relacionado con mayor riesgo de ND en la población china. Trabajos posteriores realizados sobre población caucásica europea sí han demostrado asociación del XbaI con la ND en grupo de pacientes con DM tipo 1 o tipo 2. (14,15). Más recientemente se han analizado otros SNPs relacionados con el gen del Glut-1. En concreto este grupo analizo 5 SNPs asociados al Glut-1, encontrando que los genotipos TT del HaeIII SNP y el genotipo AA del Enh2 SNP conferían mayor riesgo de ND (16). En la última década se han estudiado distintos genotipos del ACE los cuales se han relacionado con mayor predisposición para el desarrollo de ND y quizás de mayor interés, con una mayor o menor respuesta protectora al tratamiento con IECAs o ARAII (17-18). Dentro de los genes candidatos implicados en el SRAA el estudio del SNP 1166 A>C del gen AGTR1, también ha mostrado mayor riesgo de ND en distintas poblaciones asiáticas y europeas con DM tipo 1 o tipo 2. Así mismo, la asociación del genotipo DD del ACE con el 1166 A>C del AGTR1 predispuso a mayor riesgo de hipertensión e infarto de miocardio (19). Sin embargo, recientemente, el grupo de Currie y col. en una muestra amplia de pacientes blancos de origen británico con diabetes tipo 1, no han corroborado estos hallazgos y no encontraron evidencias de que los SNPs del ACE y del AGTR1 jueguen un papel importante en la susceptibilidad genética de la ND (20). Dentro de las vías que se activan en el daño renal en la DM los factores de crecimiento juegan un papel fundamental. El gen del TGFβ1 (TGFB1) y sus receptores (TGFBR1 y TGFBR2), se presentan como posibles genes candidatos al desarrollo de ND. Se han estudiado distintos SNPs asociados a estos genes, encontrando nuevamente discrepancia en los resultados. Un estudio realizado en población mejicana afectada de DM tipo 2 encontró una clara asociación con la ND y los SNPs 869T>C y 915G>C del TGFB1. Sin embargo otros análisis realizado en población irlandesa afectada de DM tipo 1 no encontró relación con ninguno de los SNPs del TGFB1 y sus receptores con la ND. (21) Como se puede observar existe discrepancia en la literatura sobre la relación de los SNPs de los genes analizados y la ND. Es probable que estas discrepancias estén en Solicitud de propuesta de investigación
relación con el relativo bajo tamaño muestral, diferencias raciales y de origen genómico, diferencias en la predisposición genética de la DM tipo 1 respecto a la DM tipo 2, heterogeneidad en los criterios de inclusión, entre otras. En este sentido cabe destacar los errores de inclusión de los pacientes en el grupo con ND, ya que este criterio se basa en la presencia o no de microalbuminuria la cual no es un marcador especifico de ND y así mismo tiene un poco valor predictivo en la aparición posterior de macroalbuminuria y ND establecida (22). En este campo la detección de nuevos biomarcadores capaces de detectar daño renal en estadios más precoces y con una relación más específica con la ND abrirían un campo prometedor en el manejo de esta enfermedad. En nuestro estudio proponemos valorar algunas de las proteínas que han sido recientemente consideradas de interés como complemento, o bien como sustitutas de los niveles de albumina en orina en el diagnostico de la ND. El colágeno tipo IV es el mayor componente de la matriz extracelular glomerular y su nivel en orina puede reflejar el grado de turnover de la matriz en la enfermedad renal. Watanabe y col mostraron que el colágeno IV está presente sólo en la orina de pacientes con microalbuminuria asociada a ND y no en aquellas afectaciones renales por otra patología. Su presencia elevada en orina es uno de los criterios de diagnostico precoz que utiliza el Japanese Diabetic Nephropathy Committe (23). Los podocitos son estructuras claves en la barrera de filtración glomerular, su presencia o la de sus proteínas en la orina se presentan como potenciales biomarcadores de daño renal en la DM. La nefrina es una proteína especifica de podocitos, la cual está ausente en la orina de pacientes no-diabeticos y en la orina de diabéticos tipo 1 sin microalbuminuria. Algunos estudios han sugerido que hay una relación directa entre la perdida de función renal en la diabetes y la presencia en orina del ARNm de la nefrina y la podocina (24-25). Peptidomas urinarios. Merchant y col demostraron que los pacientes con estadios precoces de ND presentaban un aumento de los niveles urinarios de Cadherin-like protein, FAT supresor-2, IPP2K y ZO-3, los cuales también estaban aumentados en la histología renal de pacientes con DN (26-27). La IL-18, es una citoquina pro-inflamatoria relacionada con el daño tubular en la insuficiencia renal aguda, algunos estudios han mostrado que está sobrexpresada en los pacientes con ND en comparación con pacientes con proteinuria por otra causa (28). La proteína beta-inducida h3 (Betaig h3), es una proteína de matriz extracelular que esta inducida por el TGFβ1. Algunos autores han observado que el ratio urinario Betaig h3/creatinina está claramente aumentado en los pacientes con DM tipo 2, incluso sin albuminuria, respecto a los controles. (29-30). En resumen, la patogénesis de la ND es claramente multifactorial y en ella están implicados numerosos genes, proteínas y factores ambientales. Se han propuesto numerosas causas metabólicas y hemodinámicas entre las que el trasportador de glucosa Glut-1, el SRAA y la activación de factores de crecimiento parecen ser vías relacionadas entre si, jugando un papel crucial en el desarrollo de la misma. En el manejo de la diabetes y sus complicaciones es importante identificar factores predictivos de ND para facilitar el diagnostico precoz y la realización de profilaxis y tratamientos dirigidos. En este sentido la identificación de factores genéticos predisponentes y de nuevos biomarcadores se abren como nuevas líneas de estudio. Solicitud de propuesta de investigación
Hipótesis:
La ND es una patología con una base genética compleja. Tanto la práctica clínica
como estudios poblacionales sugieren la existencia de una predisposición genética
al desarrollo de esta entidad. Nosotros sugerimos que diferencias genéticas asociadas a los genes que codifican el Glut-1, algunos componentes del SRAA y del TGFβ1 podrían predisponer a mayor riesgo de ND bien por si solos o bien la presencia de asociación entre algunos de ellos. Existen nuevos biomarcadores emergentes a los que se les ha presupuesto mayor sensibilidad en la detección precoz del daño renal asociado a la DM así como mayor especificidad en la discriminación de proteinuria por otras causas no asociadas a DM. Creemos que el estudio de estos biomarcadores conjuntamente con los parámetros clásicos que definen la ND como la microalbuminuria, aportarán más información sobre el diagnostico precoz de esta entidad. Por otra parte disminuirían los sesgos de inclusión de pacientes en el grupo control y grupo ND mejorando los posibles resultados de asociación con los SNPs de los genes estudiados.
Objetivos:
El objetivo fundamental de este estudio es determinar la presencia de factores genéticos que contribuyan al riesgo de desarrollar ND. Este conocimiento permitiría diseñar acciones preventivas en los pacientes con riesgo alto. Este objetivo principal se desglosa en los siguientes: 1-Caracterizar la variación genómica de SNPs seleccionados en genes candidatos relacionados con el metabolismo de la glucosa (SLC2A1), el SRAA (ACE1, ANGTR1 y AGT) y factores de crecimiento (TGFβ1 y TGFβ1R). 2-Estudiar la presencia de biomarcadores emergentes relacionados con detección precoz de ND, en el momento inicial y a los tres años de seguimiento de los pacientes. 3-Encontrar la posible asociación entre las variables genéticas encontradas y la presencia de ND, comparando los parámetros clásicos de microalbuminuria y estratificando con los nuevos biomarcadores asociados a daño renal. 4-Comprobar los efectos de las variables génicas encontradas, en un modelo “in vitro”, de células mesangiales expuestas a concentraciones elevadas de glucosa. Solicitud de propuesta de investigación
Metodología y mediciones:
Diseño:
El proyecto constará de tres partes. En primer lugar se realizará el reclutamiento de
una cohorte bien caracterizada de pacientes diabéticos tipo 2, los cuales se distribuirán en dos grupos según criterios de presencia o no de nefropatía diabética (ver criterios de inclusión). Sobre todos los pacientes incluidos se realizará estudio de los polimorfismos (SNPs) de los genes interés. En un segundo paso se estudiarán los biomarcadores descritos. Su presencia como marcadores de ND incipiente podría modificar los pacientes del grupo-control al grupo-ND y en ese caso, nuevamente volveremos a correlacionar los resultados con los SNPs estudiados en esa población. El análisis de los biomarcadores se pretende hacer en el momento inicial y a los tres años, para valorar la variación temporal de los mismos. Por último se propone un estudio “in vitro” con células mesangiales que se modificarán genéticamente, en base a los SNPs interés detectados en el estudio poblacional, con la idea de estudiar los efectos de estas alteraciones génicas en la producción de proteínas de matriz extracelular. Reclutamiento de pacientes: Los pacientes para el estudio serán reclutados de dos fuentes principales. Por una parte pacientes incluidos en el estudio NEFRONA, de donde obtendremos principalmente pacientes que se incluirán en el grupo-ND, y por otra parte pacientes del Parc de Salut Mar, tanto de las consultas del Servicio de Nefrología como del Servicio de Endocrino. Los criterios de inclusión en el estudio serán pacientes de ambos sexos, con edades comprendidas entre 18 y 80 años, diagnosticados de DM tipo 2 establecida, diagnosticada bien por el nefrólogo bien, por el endocrino, en tratamiento médico con antidiabéticos orales o insulina, excluyendo los pacientes que estén únicamente bajo tratamiento dietético. Los criterios de inclusión en el grupo-control (diabéticos sin ND) serán pacientes con diagnostico de DM tipo 2 de al menos 10 años de duración con función renal normal (FG estimado >60mL/min), sin presencia de microalbuminuria (<30mg/dL) Los criterios de inclusión en el grupo-ND (diabéticos con ND) vendrán dados por la presencia de microalbuminuria (30-299mg/dL) o macroalbuminuria (>300mg/dL) independientemente del grado de función renal y en ausencia de criterios clínicos o analíticos de otra afectación renal no-diabética. Serán excluidos los pacientes de raza no caucásica. De todos los pacientes incluidos se obtendrán datos de la historia clínica, que incluirá variables socio-demográficas, datos específicos de la enfermedad renal, de comorbilidad, tiempo del diagnostico de DM y tratamientos médicos actuales. Se registrarán las variables de talla, peso, IMC y medida de presión arterial. A todos los participantes se les extraerá muestra sanguínea para obtención de suero, plasma, ADN y orina. En el caso de los pacientes reclutados del proyecto NEFRONA, se solicitará al grupo organizador la posibilidad de obtener orina de dichos pacientes en la segunda visita del estudio o bien se valorará la obtención de muestras de orina de dichos pacientes mediante el contacto con sus centros de origen. Las muestras de sangre y orina se almacenarán siguiendo procesamiento estándar y se almacenaran hasta su uso. Se obtendrán las variables analíticas básicas de bioquímica (incluyendo función renal mediante la estimación del filtrado glomerular y perfil lipídico), hemoglobina glicada, albuminuria y hemograma. Dichas determinaciones se realizarán en el laboratorio de nuestro centro en el caso de aquellas muestras que no provengan de Solicitud de propuesta de investigación
los pacientes reclutados por la plataforma del estudio NEFRONA. Variables: Se estudiarán un total de seis genes candidatos a desarrollo de ND, los cuales han sido previamente descritos en la literatura. Dichos genes activan distintas vías fisiopatológicas que han mostrado estar inter-relacionadas en estudios experimentales relacionándose con el daño renal en la diabetes Los genes que se estudiarán son: SCL2A1, ACE1, AGT, AGTR1, TGFβ1 y TGFβR. La detección de SNPs en dichos genes se realizará con el soporte técnico del IMIM y del Center for Genomic Regulation (CRG) de Barcelona. La detección de dichos SNPs se realizará en base a evidencias de la literatura y mediante el uso de bases de datos HapMap. Este grupo colaborará así mismo con el proceso de genotipado. Se analizarán biomarcadores urinarios en base a evidencias encontradas en la literatura que los propone como marcadores emergentes de daño precoz en la diabetes. Los biomarcadores que se determinarán serán; colágeno IV, nefrina y podicina, peptidomas urinarios descritos previamente, IL-18, Betaig h3 y TGF β1. Proceso de genotipado: Tras la extracción del ADN mediante técnicas convencionales se realizará el proceso de genotipado mediante tecnología Taqman Las sondas serán prediseñadas en base al número de SNPs que se vayan a valorar por el grupo colaborador del CRG. Detección de biomarcadores: Los biomarcadores de interés serán analizados mediante técnica de ELISA tipo sandwich. Para aquellos biomarcadores que no tengan kit de ELISA comercial como los peptidomas urinarios, se diseñará, un Kit propio en el laboratorio de nuestro grupo de investigación utilizando anticuerpos monoclonales y policlonales disponibles comercialmente. Cultivos celulares: En el caso de que alguno de los polimorfismos situados en la región promotora de un gen demuestre predisposición a padecer ND, se hará un estudio adicional en cultivos de células mesangiales para valorar el efecto de cada alelo del SNPs sobre la expresión de proteínas de matriz extracelular, en medios de cultivo con distintas concentraciones de glucosa, como el colágeno I y IV y la fibronectina. La detección de estas proteínas se realizaría mediantes técnicas de western-blot. Se buscará la secuencia genómica y se diseñarán los oligonucleótidos apropiados para la amplificación. El producto obtenido se clonará en un vector reportero con actividad luciferasa. Con estos vectores se transfectarán las líneas celulares mesangiales sobre las que se harán los estudios posteriores. Dichos estudios se realizaran en el laboratorio de nuestro grupo de investigación. Para el análisis estadístico contaremos con el asesoramiento del personal del IMIM y del CRG. En primer lugar se determinará si las poblaciones están en equilibrio Hardy-Weinberg para los SNPs estudiados. Las frecuencias alelicas de cada variante serán comparadas mediante chi cuadrado calculando las “odd ratio” y los IC de 95%, interpretando el resultado estadísticamente significativo para p<0.05. Se hará un análisis multivariante agrupando a los pacientes según las distintas características demográficas y clínicas para determinar una posible asociación con nuestra variable principal que es la presencia de ND. Se analizarán las diferencias entre los grupos en cuanto a la frecuencia de los distintos haplotipos. Para determinar el grado de desequilibrio de ligamento entre los SNPs, se empleará el programa informatico Thesias. Los datos bioquímicos, incluidos los niveles de biomarcadores y análisis convencionales sanguíneos se analizarán mediante ANOVA, agrupando por los distintos genotipos. Solicitud de propuesta de investigación

Número de pacientes que se necesitan para el estudio:

La búsqueda de SNPs candidatos en estudios transversales caso-control, exige un
número amplio de pacientes. Es probable que los resultados discrepantes
encontrados en este campo este en relación con el bajo tamaño de las muestras analizadas. Basándonos en la población visitada en nuestro centro, tanto en consultas del servicio de endocrinología como el de nefrología, junto con el aporte de las muestras del biobanco del proyecto NEFRONA, pretendemos reclutar 800 pacientes, repartidos entre el grupo control y el grupo con ND.
Duración estimada del proyecto:

Tres años.
Resultados esperados del proyecto:

Esperamos encontrar SNPs relacionados con los genes candidatos estudiados, cuya
presencia predispongan a mayor riesgo de desarrollo de ND. La detección de dichos SNPs ayudaría en el entendimiento de la fisiopatología diabética y permitiría una detección precoz de pacientes de riesgo que podría modificar la profilaxis primaria y la actitud terapéutica en dichos pacientes. Como objetivo secundario en este trabajo esperamos relacionar algunos de los biomarcadores que se han considerado recientemente de interés, como complementarios o incluso capaces de remplazar a la microalbuminuria, con la ND. Por último esperamos demostrar en estudios “in vitro” el efecto modulador que produce la presencia de dichos SNPs en la producción de proteínas de matriz extracelular en las células mesangiales.
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Source: http://www.nefrona.es/wp-content/uploads/2011/02/PropuestaNefrona_hospitaldelmar.pdf